Настоящий стандарт рассматривает первый этап - испытания in vitro, проводимые суспензионным методом с целью определения антимикробной активности ДС и входящих в их состав ДВ в отношении конкретных микроорганизмов.

4 Суспензионный метод

4.1 Тест-микроорганизмы для испытаний

Для проведения испытаний используют устойчивые к ДС микроорганизмы, соответствующие установленным в [1] требованиям и приведенные в таблице 1.

Таблица 1 - Тест-микроорганизмы для определения антимикробной активности

Микроорганизм	Штамм
Escherichia coli	АТСС 10536
Staphylococcus aureus	АТСС 6538-Р
Pseudomonas aeruginosa	АТСС 15442
Mycobacterium terrae	DSM 43227
Candida albicans	АТСС 10231
Trichophyton mentagrophytes	АТСС 9533
Aspergillus brasiliensis	АТСС 16404
Bacillus cereus	АТСС 10876
Poliovirus типа 1 Sabin	LSc2ab
Adenovirus 5 типа	Аденоид 75

4.2 Питательные среды для культивирования тест-микроорганизмов:

Escherichia coli - питательная среда для выделения энтеробактерий (агар Эндо-ГРМ) и питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-бульон);

Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus - питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-агар) и питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-бульон);

Mycobacterium terrae - среда Левенштейна - Йенсена и картофельно-глицериновый бульон;

Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Aspergillus brasiliensis - питательная среда N 2 ГРМ (Сабуро) и питательная среда для культивирования дрожжей и грибов сухая (бульон Сабуро сухой);

Bacillus cereus (вегетативная форма) - питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-агар) и питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-бульон);

Poliovirus типа 1 Sabin (вакционный штамм LSc2ab) - среда Игла MEM с двойным набором аминокислот и глутамином;

Adenovirus 5 типа - среда Игла MEM с двойным набором аминокислот и с глутамином.

4.3 Температура и время инкубирования тест-микроорганизмов:

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus - (37   1) °C - 48 ч (на плотной среде), 7 сут (на жидкой среде);

Mycobacterium terrae - (37   1) °С - 21 сут;

Candida albicans - (27   1) °С - 48 ч (на плотной среде), 10 сут (на жидкой среде);

Trichophyton mentagrophytes - (27   1) °С - 28 сут;

Aspergillus brasiliensis - (37   1) °С - 48 ч (на плотной среде), 10 сут (на жидкой среде);

Bacillus cereus - (37   1) °С - 48 ч (на плотной среде), 7 сут (на жидкой среде);

Poliovirus типа 1 Sabin (вакцинный штамм LSc2ab) - (36   1) °С, 5 сут (один пассаж);

Adenovirus 5 типа - (36   1) °С - 5 сут (один пассаж).

4.4 Приготовление суспензии тест-микроорганизмов

Рабочую суспензию тест-микроорганизма для определения антимикробной активности готовят из культуры данного тест-штамма, выращенного на плотной питательной среде при температуре и в течение времени, оптимальных для данного тест-микроорганизма в соответствии с [1]. Для приготовления микробной взвеси культуру смывают с агара стерильным физиологическим раствором. Полученную взвесь фильтруют с помощью стерильного ватно-марлевого фильтра и разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации   клеток в 1 см ³, соответствующей трем единицам Мак-Фарланда, определяемым с помощью денситометра.

Приготовление рабочей культуры тест-вируса и порядок проведения испытаний по определению вирулицидной активности осуществляют в соответствии с [1], пункт 5.7.3.

4.5 Применение нейтрализаторов

Для нейтрализации антимикробного действия ДС из различных химических групп применяют следующие нейтрализаторы:

- для алкилдиметилбензиламмония хлорида, полигексаметиленгуанидин гидрохлорида, третичного амина - универсальный нейтрализатор (твин 80 - 3 %, сапонин - 3 %, гистидин - 0,1 %, цистеин - 0,1 %, лецитин - 0,1 %);

- для глутарового альдегида - универсальный нейтрализатор;

- для перекиси водорода, хлорамина, натриевой соли дихлоризоциануровой кислоты - 1,0 %-ный раствор тиосульфата натрия;

- для спиртов - универсальный нейтрализатор.

4.6 Приготовление испытуемых растворов

Испытуемые растворы ДВ или ДС готовят по ГОСТ Р 58151.4, используя в качестве растворителя стерильную дистиллированную воду.

4.7 Проведение испытаний

4.7.1 Аппаратура и материалы

4.7.1.1 Термостат любой конструкции, позволяющий установить температуру инкубирования в зависимости от используемого тест-микроорганизма.

4.7.1.2 Пробирки лабораторные стеклянные по ГОСТ 25336.

4.7.1.3 Чашки Петри по ГОСТ 25336.

4.7.1.4 Часы по ГОСТ 27752.

4.7.1.5 Вода дистиллированная по ГОСТ Р 58144.

4.7.2 Порядок проведения испытаний

В стерильную химическую пробирку (число пробирок должно соответствовать числу используемых концентраций) помещают 4,5 см ³ испытуемого раствора ДВ или ДС соответствующей концентрации, в которую добавляют 0,5 см ³ взвеси, содержащей мк/см ³ тест-микроорганизма, и тщательно перемешивают.

Время воздействия в зависимости от средней устойчивости микроорганизмов к испытуемой группе ДВ или ДС устанавливают:

- для наиболее чувствительных микроорганизмов (бактерий в вегетативной форме) - до 15 мин;

- для умеренно устойчивых (грибов, кроме плесневых, микобактерий и вирусов) - до 30 мин;

- для устойчивых (плесневых грибов) - до 60 мин;

- для наиболее устойчивых (бактерий в споровой форме) - 120 мин и более.

При определении антимикробной активности кожных антисептиков для установления времени воздействия включенных в них ДВ учитывают предъявляемые к ним требования, а именно наличие широкого спектра антимикробного действия в течение короткого промежутка времени (с учетом устойчивости тест-микроорганизмов к спиртам). Данный промежуток времени должен быть установлен:

- для наиболее чувствительных микроорганизмов (бактерий в вегетативной форме) - до 0,5 мин;